中华肝脏病杂志网络版2002网络论文·论著                                          CJH-NET024刘光泽  贾彦征  熊一力  易学瑞  张宜俊【摘要】 目的  连续给予高剂量基因重组治疗性乙肝疫苗后，观察小鼠血清产生抗-HBs-IgG水平及其亚类变化，了解对机体免疫系统及免疫反应类型的变化情况，以协助检验其安全性。方法 给药剂量为600μg/kg（约为人临床拟用量的600倍），每天给药一次，连续21天，然后停药恢复期一个月，用ElisA法检测小鼠血清抗-HBs-IgG及亚类（IgG1、IgG2a）。结果  高剂量乙肝疫苗仍可刺激机体在3周和恢复期产生高水平抗-HBs-IgG和IgG1，但抗-HBs-IgG2a出现较迟，在给药3周后未检测出，到停药一月后方可测出，且水平较低。结论 高剂量乙肝疫苗对机体免疫系统无毒性作用，可刺激机体产生高水平特异性抗体，但对特异性细胞免疫（IgG2a）表现一定抑制作用，性别对诱导机体产生抗-HBs-IgG及亚类没有影响。【关键词】治疗性乙肝疫苗；抗-HBs-IgG；IgG1；IgG2aEffect of therapeutic hepatitis B surface antigen Vaccine on anti-HBs-IgG and Its subclass In the long-term toxicity test of mice. Liu Guangze, Jia Yanzheng, Xiong Yili, et al,The Infectous Disease Centre of PLA Guangzhou 510602【Abstract】Objective To study the safe and the specific immune responses of anti-HBs-IgG and subclass in mice, after serial Vaccted high dosage of hepatitis B surface antigen. Methods  NIH mice were treated with 600μg.Kg-1.d-1 by hypodermic injection for 21d, then one monthly  convalesent term. Anti-HBs-IgG and its subclass(IgG1、IgG2a) in mice sera  were dectected by Elisa. Results  the high dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine still excited body product high levels of anti-HBs-IgG and Its IgG1 in 3th week and convalesent phase, but low levels of IgG2a not Could be deteeted untill Convalesent phase. Conclusion  The results shows that the high dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine is safe, and still has strong antigencity in humoral immunity but has inhition in cellular immunity(IgG2a), sex has no effects on inducing IgG and its subclass.【Key words】 therapeutic Vaccine；anti-HBs-IgG；IgG1；IgG2a 近年的研究表明，一些慢性乙型肝炎患者在接种含有HBsAg或其他HBV相关蛋白疫苗后可检测到特异性免疫反应，并取得抗病毒效果[1-4]。因此治疗性疫苗的研制为慢性乙肝治疗提供了一个新的研究方向。本中心与深圳康泰公司合作利用基因重组技术研制出大剂量治疗性乙肝疫苗，通过对HBV转基因小鼠模型和正常鼠研究，显示出良好增强改善机体特异性细胞和体液免疫应答作用，同时进行了猴和小鼠长期毒性试验研究。目前对治疗性乙肝蛋白疫苗和DNA疫苗诱导机体产生特异性抗体及亚类的研究已有些报道[5-6]，但高剂量治疗性疫苗诱发机体产生抗-HBs-IgG及其亚类变化研究还是空白。本研究目的就是对高剂量（约为人临床拟用量600倍）治疗性乙肝疫苗对小鼠长期毒性试验中观察（ⅰ）诱发小鼠产生抗-HBs-IgG水平及免疫反应类型变化情况；（ⅱ）小鼠性别对机体产生抗-HBs及亚类是否存在影响；（ⅲ）协助检测治疗性疫苗的安全性。材料与方法1.1 试验材料：治疗型乙肝疫苗由深圳康泰股份有限公司制备，批号：T010702，每支1ml，乙肝疫苗60μg。临用前将所需用量的乙肝疫苗用量的乙肝疫苗用铝稀释剂稀释，配成所需的注射溶液。1.2 小鼠来源、分组及血清采集：SPF级NIH小鼠，雌雄兼半，体重为18~24g，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验分为给药组和对照组，给药剂量为600μg/kg（约为人临床拟用量的600倍数），每天给药一次，连续21天，皮下注射，0.2ml/只，对照组注射等体积铝稀释剂，每组30只，于给药3周和停药恢复期（一个月）结束，每组分别取10只小鼠眼静脉取血，分离血清保存于-20℃待测。1.3 抗-HBs-IgG及IgG亚类检测：抗-HBs ElisA检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1为Serotec公司产品，作为第二抗体检测小鼠血清中抗-HBs-IgG1和IgG2a水平。结   果2.1 实验小鼠诱生抗-HBs变化：连续给予高剂量治疗性基因重组乙肝疫苗，3周可诱导全部小鼠机体产生高水平的抗-HBs，停药后一个月恢复期后，小鼠血清中抗-HBs-IgG仍保持高水平并有增高趋势（见表1），表明高剂量乙肝疫苗仍可刺激机体产生高水平特异性抗-HBs抗体，未产生毒性或耐受作用。表1  高剂量诱导试验鼠产生抗-HBs-IgG结果（X±S） 例  数抗-HBs水平（OD）阳性率（%）对照组10<0.050试验组（3W）101.891±0.702*100试验组（恢复期）102.297±

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0.328*100*P>0.052.2 特异性抗-HBs-IgG亚类的变化：对特异性抗-HBs-IgG亚类ElisA测定，表明连续给予高剂量乙肝疫苗3周时诱导抗体产生抗-HBs-IgG的亚类主要为IgG1，产生IgG2a阳性率仅为10%，且滴度很低，到恢复期结束抗-HBs-IgG2a水平才有显著增高，见阳性率可达到90%，但与IgG1 OD值相比低8倍多。抗-HBs-IgG1仍保持高水平，与3周时滴度水平无显著差异（见表2），这表明高剂量乙肝疫苗对诱导机体产生抗-HBs-IgG2a在水平和时间上均表现出有一定抑制作用。表2  抗-HBs-IgG的亚类分布情况（X±S）组  别例数IgG2aIgG阳性率（%）IgG1IgG1阳性率（%）对照组10<0.050<0.050试验组（3W）100.050±0.043101.827±0.332*100恢复期（1月）100.232±0.045**901.894±0.304*100**P<0.05,*P>0.052.3 性别对实验小鼠产生抗-HBs及其亚类分布的影响：本文分析性别对实验小鼠产生抗-HBs及其亚类分布的影响，各组内性别对产生抗-HBs及IgG1、IgG2a均无明显差异，表明性别对乙肝疫苗刺激小鼠产生抗-HBs-IgG及IgG1、IgG2a无显著影响（见表3）。表3  实验小鼠性别对抗-HBs及其亚类分布的影响（X±S）*P>0.05      抗-HBs-IgG(OD)IgG1(OD)IgG2a(OD)实验组（3W）♂(5)  1.911±0.576*1.927±0.118*0.055±0.059*♀(5)  1.871±0.881*1.694±0.514*0.046±0.027*恢复期（一个月）♂(5)  2.264±0.186*1.822±0.273*0.182±0.066*♀(5)  2.330±0.453*1.965±0.3480.282±0.191*讨   论治疗性乙肝疫苗研究为慢性乙型肝炎的治疗提供了一个研究方向和治疗手段，本中心对治疗性乙肝疫苗在小鼠和猴长期毒性试验研究，通过血液学、血液生化学及组织病理学等分析表明，治疗性乙肝疫苗对机体是安全的，无毒性作用。本研究对小鼠抗-HBs-IgG及其亚类的测定表明高剂量乙肝疫苗对小鼠机体免疫无毒性作用，仍可刺激机体产生高水平抗-HBs-IgG1，这一研究填补高剂量治疗性乙肝疫苗诱导机体免疫系统研究的空白，丰富了治疗性乙肝疫苗的研究内容。目前对治疗性乙肝疫苗对慢性乙型肝炎的治疗作用机制尚未阐明，可能是通过改变增强抗原提呈的方式，诱生淋巴因子和细胞因子来刺激T细胞反应，主要产生特异性CTL而产生治疗效应，Cocillin等[1]对GenHerac B疫苗接种的CHB患者中，抗原特异性PBMC增殖反应率明显高于对照组，有41.2%的患者发生强而持久的细胞免疫反应。本课题组用治疗剂量乙肝疫苗对小鼠试验，通过T淋巴试验，特异性CTL试验细胞因子IL-2、IFN-γ及抗-HBs-IgG2a检测，都表明治疗性乙肝疫苗可显著增强机体细胞免疫（文章待发表）。治疗性蛋白疫苗和DNA疫苗不同已往预防疫苗的重要区别于其可显著提高了机体细胞免疫，特别是特异性CTL免疫，打破免疫耐受，而达到治疗CHB作用[7,8]。近十年来对鼠和人研究表明，细胞因子是IgG亚类反应的主要调控因素。在小鼠中，Th1主要分泌IL-1和IFN-γ，促进IgG2a亚类的产生，诱导细胞免疫和激活T杀伤性细胞，而Th2则分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，促进IgG1亚类的合成关与变态反应有关，因此在免疫和疾病中检测IgG亚类变化，可以监测机体抗体变化及免疫反应类型的变化[9，10]。蛋白疫苗和DNA疫苗一些研究已表明，注射治疗性疫苗可刺激抗体产生的IgG2a为主的免疫反应（即Th1型为主），但在本研究中，实验结果表明高剂量治疗性乙肝疫苗可刺激抗体产生高水平IgG1为主的免疫反应（即Th2型），并持续时间较长，而IgG2a的产生水平很低，出现时间较迟，这表明高剂量治疗性乙肝疫苗虽对机体免疫系统无毒性作用，可产生高水平抗-HBs-IgG1，但对细胞免疫反应有一定抑制作用，而表现出抗-HBs-IgG2a水平很低，出现较迟。IgG2a与IgG1 OD值差约8倍。从一般免疫理论来说，大剂量蛋白抗原的反复刺激容易诱导特异性T淋巴细胞耐受，抑制免疫反应，而大量的多糖类抗原可以诱导特异性B细胞耐受，从而抑制抗体的产生[11]。本研究结果与上述免疫应答的调节理论相一致。此外本研究分析性别对高剂量乙肝疫苗诱导机体免疫反应，通过对抗-HBs-IgG及IgG1、IgG2a检测分析，表明性别对高剂量乙肝疫苗诱导机体免疫反应无影响。上述试验结果表明了高剂量治疗性乙肝疫苗对机体无毒性作用，治疗性乙肝疫苗是安全的，连续给予高剂量乙肝疫苗仍可诱导机体产生高水平抗-HBs-IgG及IgG1，但对细胞免疫有一定抑制作用，使抗-HBs-IgG2a水平很低，产生时间延迟，性别对上述试验结果无明显影响。致谢 本试验由广州医药工业研究所全国临床前药品安全性重点研究室具体实施，对本研究帮助表示感谢！参 考 文 献[1]Couillin I, Pol S, Mancini M, Driss F, Brechot C, Tiollais P and Michel ML. Specific Vaccine Therapy in chronic Hepatitis B: induction of T Cell Proliferative Responses Specific for Envelope Antigens. J infect Dis 1999.180(1):15-26[2]Pols, Driss F, Michel ML, Nalpas B, Berthelot P, Brechot C. Spcific Vaccine therapy in chronic hepatitis B infection. Lancet 1994;349:342[3]Ishioka GY, Fikes J, Hermanson G, Livingstone B, Crimi C, Del Guercio MF, Oseroff C, Utilization of MHC class I transgenic mice for the development of minigene Vaccine encoding multiple HLA-restricted CTL epitopes. J Immunol 1999;162:3915-3925.[4]Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisar FV, Fikess J, Grey H. The hepatitis B Virus-specific CTL responses induced in humans

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by lipopetide Vaccination are Comparable to those elicited by acute viral infection. J Immunol 1997;1383-1392.[5]黄祖瑚，卢山，刘宁，王世霞，HBcAg DNA疫苗诱导（H-2b）特异性细胞和体液免疫应答，中华传染病杂志，1999年5月17（2）：104-107[6]Gregorek H,Madalinski K, Woynarowski M, Mikolajewicz J, Syczewska M, Socha J. The IgG subclass profile of anti-HBs response in vaccinated children and children seroconverted after natural infection.Vaccine 2000(18):1210-1217.[7]Kuhober A, Pudollek HP. DNA immunization inducal antibody and cytotoxic T Cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice. J Immunol 1996;156:3687-3695.[8]Geissler M, Tokushige K, Chante CC. Cellular and humoral immune response to hepatitis B Virus structure proteins in mice after DNA-based immunization. Gastroenterology,1997;112:1307-1320.[9]Snapper CM, Mond JJ. Towards a comprehensive view of immunoglobulin calss switching. Immunol Today 1993;14:15-7.[10]Kawano Y, Noma T, Kou K, Yoshizawa I, Yata J. Regulation of human IgG subclass production by cytokines: human IgG subclass production enhanced differentially by interleukin-6 Immunology 1995;84:278-84.[11]林学颜，张琴主编，现代细胞与分子免疫学，北京科学出版社，1999年8月出版，200-203.作者单位：广州，中国人民解放军感染疾病中心 510602

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